赭曲霉毒素A（Ochratoxin A）ELISA检测试剂盒说明书

【概要】

赭曲霉毒素A （Ochratoxin A）是曲霉属和青霉属的真菌形成的次级代谢产物，属烈性的肾脏毒和肝脏毒，广泛存在于各种食物中。谷物及其副产品是赭曲霉毒素A的主要来源。动物实验表明摄入了被这种毒素污染的饲料后，会发生急性或慢性中毒症。防止污染赭曲霉毒素A的食品和饲料直接或间接地进入人类食物链，加强对赭曲霉毒素A的检测十分重要。

【适用范围】

可定性、定量检测谷物、饲料、面粉、啤酒、红酒、饮料等样本中的赭曲霉毒素A。

【试验原理】

本试剂盒采用竞争ELISA，在微孔板上预包被赭曲霉毒素A抗原，加入样本/赭曲霉毒素A标准品溶液及辣根过氧化物酶标记的赭曲霉毒素A抗体。样本或标准品溶液中的赭曲霉毒素A与预包被在微孔板上的赭曲霉毒素A抗原竞争结合辣根过氧化物酶标记的赭曲霉毒素A抗体。未结合的酶标抗体在洗涤时被除去，再加入显色液，读取吸光值。样本的吸光值与其所含残留物赭曲霉毒素A抗原的含量成负相关。对照标准曲线，即可得出相应残留物赭曲霉毒素A的含量。

【试剂盒灵敏度】

   试剂盒灵敏度：1ppb

【交叉反应率】

   结构类似物                                                          交叉反应率

  赭曲霉毒素A   ……………………………………………………………  100%

  赭曲霉毒素B   ……………………………………………………………   43%

  赭曲霉毒素C   ……………………………………………………………     5%

【试剂盒组成】

1. 96孔板×1块

2. 标准液×6瓶：（2ml/瓶）

0ppb, 1ppb, 3ppb, 9ppb, 18ppb, 54ppb

3. 酶标物 1瓶   …………………………………… 7ml

4. 显色液1瓶   …………………………………… 12ml

5. 终止液1瓶   …………………………………… 10ml

6. 浓缩洗涤液（10×）1瓶 …………………… 50ml

7. 浓缩样品稀释液（10×）1瓶……………… 20ml

【需要而未提供的设备及试剂】

设备：

---微孔板酶标仪450nm

---振荡器

---粉碎机

---离心机

---微量天平

---微量移液器：单道 20µl～200µl、200µl～1000µl、多道 300µl

试剂：

---去离子水（或蒸馏水）

---二氯甲烷

---盐酸

---NaHCO3

【试剂配制】

1. 样品稀释液：将浓缩样品稀释液用去离子水按1:9体积比进行稀释（1份浓缩样品稀释液+9份去离子水）。

2. 洗涤工作液：将浓缩洗涤液用去离子水按1:9体积比进行稀释（1份浓缩洗涤液+9份去离子水）。

【样品前处理步骤】

一、谷物与饲料（稀释倍数：2.5）

1. 称取1g粉碎的样品，加入0.5ml 0.13M NaHCO3，震荡1min，

2. 加入2ml样品稀释液，震荡5min；

3. 室温下，2000g离心15min；

4. 取100μl待测。

二、果汁、啤酒、饮料（稀释倍数：1）

1. 碳酸饮料应去除CO2（60℃水浴或振荡去除）

2. 取2ml 样品，加入 1ml 1mol/L HCl 振匀，加入2ml CH2Cl2 振匀 3min；

3. 室温下，3500g离心10min；

4. 去除上层液，吸取下层1ml,加入800μl样品稀释液，强烈振荡3min；

5. 室温下，3500g离心10min；

6. 取480μl上层液，加入120μl甲醇，振荡均匀，取100μl待测。

【检测步骤】

一、 测定前须知：

1. 使用之前将所有试剂和所需板条回温（20～25℃）。

2. 使用之后立即将所有试剂及剩余板条放置2～8℃，干燥环境保存有利于保持试剂稳定性。。

3. ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA操作中的要点。

4. 在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。

二、操作步骤：

1. 将所需试剂及微孔板取出，放置室温（20～25℃）30min以上，液体试剂使用前均须摇匀。

2. 取出所需数量的微孔板，将不用的微孔板与干燥剂一起重新真空密封，放置于2～8℃。不可冷冻。

3. 洗涤工作液在使用前也需回温。

4. 将样本和标准品对应微孔编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

5. 加标准品/样本50µl到对应的微孔中，加入酶标物50µl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温避光反应15min。

6. 小心揭开盖板膜，用洗涤工作液充分洗涤，300µl/孔，洗板5次，每次间隔30s，用吸水纸拍干。

7. 加入显色液100µl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温避光反应15min。

8. 加终止液50µl/孔，轻轻振荡混匀，设酶标仪于450nm处读取每孔OD值。

【结果判定】

1. 百分吸光率的计算

标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即

百分吸光率（%）＝ B/B0 ×100%

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B0—0(ppb)标准溶液的平均吸光度值

2. 标准曲线的绘制与计算

以标准品百分吸光率为纵坐标，赭曲霉毒素A标准品浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中赭曲霉毒素A实际量。

【注意事项】

1. 室温低于20℃或试剂及样本没有恢复到室温（20～25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

2. 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3. 每种试剂使用前均需摇匀。

4. 反应终止液为0.5M硫酸，避免接触皮肤。

5. 不要使用过了有效期的试剂盒；也不要掺杂使用过了有效期的试剂盒；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。

6. 储存条件：

试剂盒保存于2～8℃，不能冷冻，将不用的微孔板重新真空密封。标准物质和无色的显色剂对光敏感，因此要避光保存。

7. 试剂变质的迹象：

显色试剂有任何颜色表明显色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5）时，表示试剂可能变质。

8. 加入显色液后，一般显色时间为15～30min。若颜色较浅，可延长反应时间到35min（或更长），但不得超过40min。反之，则减短反应时间。

9. 该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

【样品最低检测限】

   谷物、饲料  ……………………………………………  2.5ppb

   果汁、啤酒、饮料  ……………………………………   1ppb

【贮藏条件及保存期】

贮藏条件：保存试剂盒于2～8℃。

保存期：该产品有效期为12个月。