赭曲霉毒素A免疫亲和柱操作说明书

【概要】

赭曲霉毒素A （Ochratoxin A）是曲霉属和青霉属的真菌形成的次级代谢产物，属烈性的肾脏毒和肝脏毒，广泛存在于各种食物中，谷物及其副产品是赭曲霉毒素A的主要来源。动物实验表明摄入了被这种毒素污染的饲料后，会发生急性或慢性中毒症。防止污染赭曲霉毒素A的食品和饲料直接或间接地进入人类食物链，加强对赭曲霉毒素A的检测十分重要。

【适用范围及性能】

用于定性、定量检测谷物、酒类等食品和饲料等样本中的赭曲霉毒素A时的样品前处理。

柱容量：≥200ng

回收率：≥90%

【试验原理】

本产品的测定的基础是抗原抗体反应，赭曲霉毒素A单克隆抗体连接在柱内凝胶上，样品中的赭曲霉毒素A经过提取、过滤、稀释，然后将样品提取液缓慢的通过赭曲霉毒素A免疫亲和层析柱，在免疫亲和柱内，赭曲霉毒素A与抗体结合，之后洗涤免疫亲和柱除去没有被结合的其他物质。用甲醇洗脱赭曲霉毒素A，然后注入到分析仪器中用于检测。

【包装组成】

根据不同规格，每一个盒中包含5-25支赭曲霉毒素A免疫亲和层析柱及1份说明书。

【需要而未提供的设备及试剂】

设备：

┅┅高速均质器或组织匀浆机

┅┅粉碎机

┅┅200ml/50ml量筒

┅┅天平：感量0.1g

┅┅微量移液器：单道 100l～1000l

┅┅槽纹滤纸（折叠快速定性或定量滤纸）

┅┅玻璃微纤维滤纸（1.5m孔径）

┅┅50ml漏斗

┅┅一次性玻璃试管

┅┅泵流操作架（包括空气泵，不同容积的玻璃注射器等）

试剂：

┅┅甲醇（色谱级）

┅┅蒸馏水或去离子水

┅┅pH7.0磷酸盐缓冲溶液（PBS缓冲液）：称取8.0g氯化钠，1.2g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，用990mL纯水溶解，然后用浓盐酸调节pH值至7.0，最后用纯水稀释至1000mL

┅┅清洗缓冲液：25g 氯化钠+5g碳酸氢钠+0.1mL吐温-20

  用纯水稀释至1000 mL

【试剂配制】

样品提取液：配制甲醇-水（8：2）溶液作为样品提取液

【样本处理步骤】

（一）花生，玉米，大米，小麦及其制品和饲料

┅┅称取20g粉碎的样品于100mL容量瓶中，加入5.0g氯化钠，以甲醇-水（8：2）溶液定容；

┅┅转移到均质杯中，以均质器高速搅拌，提取2分钟；

┅┅4000r/min离心5min或用定量滤纸过滤；

┅┅取10mL滤液并加入40mLPBS缓冲液稀释，用玻璃微纤维滤纸过滤，取过滤后液体待测；

┅┅将免疫亲和柱连接于10.0mL玻璃注射器下。准确移取10.0mL样品提取液注入玻璃注射器；

┅┅将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约1滴/S流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2~3mL空气通过柱体；

┅┅以10.0mL清洗缓冲液淋洗柱子1次，流速为1滴-2滴/S，弃去全部流出液，

┅┅再以10.0mL水淋洗柱子1次，流速为1滴-2滴/S，弃去全部流出液，并使2mL~3mL空气通过柱体；

┅┅准确加入1.0mL色谱级甲醇洗脱，流速为1 滴/S，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。

（二）啤酒，黄酒等酒类

┅┅取10mL试样脱气后与90mLPBS缓冲液混匀，用玻璃微纤维滤纸过滤，取过滤后液体待测；

┅┅将免疫亲和柱连接于10.0mL玻璃注射器下。准确移取10.0mL样品提取液注入玻璃注射器；

┅┅将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约1滴/S流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2~3mL空气通过柱体；

┅┅以10.0mL清洗缓冲液淋洗柱子1次，流速为1滴-2滴/S，弃去全部流出液，

┅┅再以10.0mL水淋洗柱子1次，流速为1滴-2滴/S，弃去全部流出液，并使2mL~3mL空气通过柱体；

┅┅准确加入1.0mL色谱级甲醇洗脱，流速为1 滴/S，收集全

  部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。

【结果判定】

经免疫亲和柱净化后，收集到的甲醇洗脱液可直接使用荧光计或者HPLC检测，也可使用薄层色谱或者酶联免疫试剂盒进行检测。收集到的1ml洗脱液中的赭曲霉毒素A含量相当于1g样品中赭曲霉毒素A含量。

【注意事项】

┅┅赭曲霉毒素危害极大，应戴手套操作。

┅┅不要使用过了有效日期的免疫亲和柱。

【贮藏条件及保存期】

贮藏条件：亲和柱可于常温保存，2-8℃储存可延长有效期，不可冻存

保存期：该产品有效期为12个月。